活細(xì)胞相差、熒光顯微時(shí)間序列動(dòng)態(tài)觀察采集是細(xì)胞生物學(xué)研究中的重要技術(shù)手段，可實(shí)時(shí)觀察活細(xì)胞的動(dòng)態(tài)變化，以下是具體介紹：

原理：相差顯微鏡是利用光線通過(guò)透明標(biāo)本時(shí)產(chǎn)生的光程差（即相位差）轉(zhuǎn)化為振幅差（即亮度差），使無(wú)色透明的細(xì)胞結(jié)構(gòu)變得清晰可見(jiàn)，無(wú)需染色就能觀察活細(xì)胞形態(tài)。熒光顯微鏡則是通過(guò)特定波長(zhǎng)的激發(fā)光照射熒光標(biāo)記的細(xì)胞，使熒光物質(zhì)發(fā)出熒光，從而觀察細(xì)胞內(nèi)特定結(jié)構(gòu)或分子的分布與動(dòng)態(tài)變化。時(shí)間序列動(dòng)態(tài)觀察采集是在不同時(shí)間點(diǎn)連續(xù)拍攝，記錄細(xì)胞隨時(shí)間的變化過(guò)程。

設(shè)備要求：

顯微鏡：可選擇具備相差和熒光功能的倒置顯微鏡，如尼康 Ti2-E 全自動(dòng)活細(xì)胞顯微成像系統(tǒng)，其具有大視野、高速成像、高分辨率等特點(diǎn)，可進(jìn)行明場(chǎng) / 熒光圖像采集和時(shí)間序列成像。也可選擇激光共聚焦顯微鏡，如蔡司 LSM 800，能實(shí)現(xiàn)高分辨率的熒光成像，還可進(jìn)行光切片采集和三維重建，適合觀察細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)變化。

相機(jī)：需配備高靈敏度相機(jī)，如 CMOS 或 sCMOS 相機(jī)。sCMOS 相機(jī)量子效率高，可在低光照條件下獲得清晰圖像，減少光毒性對(duì)活細(xì)胞的影響，還能實(shí)現(xiàn)高速成像，滿足時(shí)間序列采集需求。

環(huán)境控制裝置：活細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)間觀察需要穩(wěn)定的培養(yǎng)環(huán)境，因此顯微鏡需配備溫控培養(yǎng)系統(tǒng)、CO?培養(yǎng)箱等，以維持細(xì)胞生存所需的溫度、濕度和氣體環(huán)境。

操作流程：

樣品準(zhǔn)備：將待觀察的活細(xì)胞接種于合適的培養(yǎng)器皿中，如培養(yǎng)皿、多孔板等。若進(jìn)行熒光觀察，需根據(jù)研究目的用相應(yīng)的熒光染料對(duì)細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，標(biāo)記方法可根據(jù)染料說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，標(biāo)記后將細(xì)胞置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一段時(shí)間，使細(xì)胞狀態(tài)穩(wěn)定。

顯微鏡設(shè)置：將培養(yǎng)器皿放置在顯微鏡載物臺(tái)上，開(kāi)啟顯微鏡及相關(guān)附件，如光源、相機(jī)、環(huán)境控制裝置等。選擇相差模式，調(diào)節(jié)焦距和光圈等參數(shù)，使細(xì)胞圖像清晰可見(jiàn)。若進(jìn)行熒光觀察，根據(jù)熒光染料的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)，選擇合適的熒光通道和濾光片組合。

時(shí)間序列參數(shù)設(shè)置：設(shè)置采集時(shí)間間隔和總采集時(shí)間，時(shí)間間隔可根據(jù)細(xì)胞變化速度確定，如細(xì)胞分裂速度較慢，可設(shè)置幾分鐘甚至幾十分鐘采集一次；對(duì)于快速變化的過(guò)程，如鈣離子信號(hào)傳導(dǎo)，可能需要每秒甚至更高頻率采集。總采集時(shí)間根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩?，可從?shù)小時(shí)到數(shù)天不等。同時(shí)，開(kāi)啟自動(dòng)對(duì)焦功能，確保在長(zhǎng)時(shí)間采集過(guò)程中細(xì)胞始終處于焦平面上。

圖像采集：設(shè)置好參數(shù)后，啟動(dòng)時(shí)間序列采集程序，相機(jī)將按照設(shè)定的時(shí)間間隔自動(dòng)拍攝圖像，記錄細(xì)胞的動(dòng)態(tài)變化過(guò)程。采集過(guò)程中，可實(shí)時(shí)查看圖像，確保采集正常進(jìn)行。

數(shù)據(jù)處理與分析：采集完成后，可使用顯微鏡配套的圖像分析軟件，對(duì)時(shí)間序列圖像進(jìn)行處理和分析，如自動(dòng)識(shí)別細(xì)胞、追蹤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)軌跡、量化熒光強(qiáng)度變化、分析細(xì)胞增殖或凋亡率等，還可將圖像制作成動(dòng)態(tài)視頻，直觀展示細(xì)胞的變化過(guò)程。